연구목표

(가) 최종목표

본 과제에서는 평활근세포에 의한 내피세포의 활성을 조절하는 기전을 이들 두 세포간의 특이적 상호작용과 신호전달을 분자 수준에서 밝힌다. 더 나아가서 평활근세포에서 발현되는 특이 유전자를 확보하고 이들 유전자 내피세포의 기능을 조절하는 기전을 밝히고자 한다. 이들 연구 결과를 기초로 혈관기능 조절물질과 혈관질환 치료제의 개발에 응용하고자 한다.

(나) 단계별 목표

단계	연 구 목 표
제 1 단계 (2001.7-2004.2)	펑활근세포에 의한 내피세포의 기능조절 및 특이 유전자 확보
	1) 평활근세포와 내피세포의 특이적 상호작용에 관련된 신호전달체계규명 2) 평활근세포의 이상 증식 조직 확보 및 프로테옴 분석 3) 내피세포 기능을 조절하는 평활근세포의 특이 유전자 확보
제 2 단계 (2004.3-2007.2)	평활근세포의 특이 유전자의 기능 규명
	4) 신규 발굴 유전자를 평활근세포와 내피세포로 형질 전환 기술 확립 5) 신규 발굴 유전자에 의한 평활근세포와 내피세포의 기능조절 연구 6) 신규 발굴 유전자에 의한 혈관 염증조절 체계 및 기전 규명
제 3 단계 (2007.3-2010.2)	평활근세포의 증식억제 및 내피세포 기능유지 치료효과 연구
	7) 평활근세포에 의한 내피세포 기능조절 신기술 개발 8) 평활근세포의 증식억제 물질 개발 및 치료법 개발 9) 신규 개발 물질 및 치료법의 in vivo intimal hyperplasia의 억제효과 검증

연구내용

본 연구에서는 평활근세포와 내피세포의 비정상적인 상호작용 및 신호전달로 인한 내피세포의 과대증식의 기전을 분자생물학 수준에서 연구하고, 이에 근거한 혈관기능 조절물질의 개발이나 치료기법을 개발에 하고자 한다. 이를 위하여 1 단계에서는 평활근세포에 의한 내피세포 기능조절의 신호전달 체계를 규명하고 및 특이 유전자를 발굴하며, 2 단계에서는 내피세포의 기능을 조절하는 평활근세포의 특이유전자의 분자적 기전을 규명, 3 단계에서는 평활근세포에 의한 내피세포의 기능조절 및 평활근세포 증식억제을 위한 조절 방법을 개발하고, 혈관질환 (예 intimal hyperplasia 등)의 치료효과를 동물 모델에서 검증하는 단계로 연구를 진행하고자 한다.

⼑ 제 1 단계: 펑활근세포에 의한 내피세포의 기능을 조절하는 신호전달 확립 및 유전자의 발굴

⼑ 평활근세포를 단독 혹은 내피세포와 공동배양하는 동안에 평활근세포와 내피세포에서 일어나는 세포의 기능 유지 및 사멸과 성장에 관련된 신호전달체계의 변화를 Western blot 및 효소활성 측정으로 확인하여 이들 세포에서 유발되는 특이적 신호전달 체계를 규명한다.

⼑ 평활근세포를 Green Fluorescence Protein (GFP)의 유전자로 형질전환 세포를 만들고 이들 세포를 정상 내피세포 및 Cu2+/H2O2로 처리하여 손상을 준 내피세포와 공동배양을 한 후 평활근세포의 증식 변화를 FACS 혹은 형광 현미경으로 측정한다. 평활근세포의 증식 변화가 확인되면 평활근세포의 기능변화에 관련된 단백질을 프로테옴 분석하고 관련 유전자를 확보한다.

⼑ 상기와 같은 공동 배양 조건에서 세포의 증식, 사멸 및 혈관 기능조절 유전자 (MAP kinase, AKT, Bcl-2계 단백질, ICAM, VCAM, VEGF, PTEN, p53, p21 등)의 활성이나 발현 변화를 분자-세포 생물학적인 방법으로 확인하고자 한다.

⼑ 더 나아가서 intimal hyperplasia의 시료를 환자와 동물모델에서 확보하여 프로테옴 분석, DNA array 및 DDPCR과 같은 기법을 이용하여 평활근세포의 증식 및 사멸 그리고 내피세포 기능조절에 관련된 평활근세포의 새로운 유전자를 확보하고자 한다.

⼑ 제 2 단계: 평활근세포의 특이 유전자의 기능 규명

⼑ GFP로 형질전환된 평활근세포와 정상 내피세포에 제 1 단계에서 확보한 신규 유전자를 도입하여 형질전환된 세포를 만든다. 신규 유전자가 도입된 평활근세포를 정상 및 Cu2+/H2O2로 처리하여 손상을 준 내피세포와 공동배양을 한 후 평활근세포의 증식 변화를 FACS 혹은 형광 현미경으로 측정한다. 이들 두 그룹간의 세포증식 변화로부터 신규 유전자의 세포성장 조절 기능을 확인한다. 역으로 새로운 유전자가 도입된 내피세포를 Cu2+/H2O2로 처리하여 손상을 준 내피세포와 손상을 주지 않은 세포를 GFP만 발현하는 평활근세포와 공동배양을 한 후 평활근세포의 증식 변화를 FACS 혹은 형광 현미경으로 측정한다. 이들 두 그룹간의 증식변화로부터 신규 유전자중 평활근세포에서 발현되어 내피세포의 기능조절 원리를 확인한다.

⼑ 평활근세포의 성장에 영향을 주는 유전자가 확인되면 이들 유전자가 평활근세포의 증식이나 사멸조절 및 혈관 염증반응을 조절하는 유전자 (MAP kinase, caspase, AKT, ICAM, VCAM, VEGF, TGF-b, NOS, Bcl-2계 단백질, PTEN, p53, p21 등)들의 활성이나 발현 변화에 어떠한 영향을 미치는지를 분자·세포 생물학적인 방법으로 확인하고자 한다.

⼑ 제 3 단계: 평활근세포의 증식억제, 내피세포 기능유지 및 치료효과 연구

⼑ 평활근세포에 의한 내피세포의 기능 조절을 체계적으로 확립하여 평활근세포에 의한 혈관 기능 조절의 새로운 feedback 기전을 규명한다.

⼑ 내피세포의 과대증식 신호전달의 target 물질을 확인하고 그 기능을 분석한다. 이를 근거로 새로운 내피세포 성장 및 기능조절 약물을 개발하거나 새로운 유전자 및 세포 치료법을 개발한다.

⼑ 선발된 약물이나 치료 기법을 동물모델에서 치료효과를 검증함으로써 다양한 혈관관련 질환의 전임상 자료로 이용하고자 한다.