연구목표

(가) 최종목표

본 세부과제 연구에서는 혈관기능조절에 중요시되고 있는 TGF-β가 병리적 환경에서 대식세포와 T cell에서 어떤 기작으로 발현이 조절되는지를 연구하고자 한다. 다음 단계에서는 TGF-β가 대식세포에서 혈관생성 촉진(VEGF, MMPs) 혹은 저해인자 (PAI-1, angiostatin)의 생성, 그리고 염증관련 cytokine의 발현을 조절하는 기전을 분석하고자 한다. 특히, TGF-β의 세포내 신호전달경로의 하부에 있는 Smad계 단백질의 신호전달체계를 구체적으로 분석하여, 혈관기능조절인자의 발현조절체계를 네트워크화 하고자 한다.

(나) 단계별 목표

 

단계	연 구 목 표
제 1 단계 (2001.7-2004.2)	면역세포의 TGF-β 발현 조절기작 규명
	1) T cell의 TGF-β1 발현에 대한 ConA, PMA (TPA), TGF-β1의 영향 규명 2) 대식세포의 TGF-β1 발현에 대한 병리적 환경 (hypoxia, LDL, IFN-γ, TGF-β1)의 영향 평가 3) 비활성 TGF-β의 활성조건 탐색
제 2 단계 (2004.3-2007.2)	TGF-β에 의한 혈관기능 조절인자 발현조절 규명
	4) LPS, IFN-γ에 의한 혈관조절인자 발현 양상 규명 5) TGF-β 유도성 혈관조절인자 발현에 미치는 hypoxia 및 LDL의 영향 규명 6) 염증반응 cytokine (Interleukin-1, 6, TNF-α등)의 발현조절 규명
제 3 단계 (2007.3-2010.2)	TGF-β1에 의한 혈관기능 조절인자 유도에 대한 신호전달기작 및 조절방법 탐색
	7) VEGF, MMPs, PAI-1 유전자 reporter 제작 및 특성평가 8) Smad 단백질의 과발현에 의한 reporter 활성 규명 9) AML-2, Ets, NF-kB 단백질의 관여여부 규명 10) 신호전달의 제어방법 탐색

연구내용

⼑ 제 1 단계: 면역세포의 TGF-β 발현 조절기작

본 연구에서는 혈관형성과 밀접한 관계에 있는 TGF-β의 발현 조건을 이해하고, 비활성의 TGF-β가 활성화되는 생리적인 조건을 조사하고자 한다.

⼑ T helper cell의 TGF-β 발현에 대한 ConA, PMA (TPA), 그리고 TGF-β1의 영향 조사

- 본인은 이미 T helper cell line이 TGF-β를 분비하는 기본적인 조건을 정착시킨 바 있다.

- 본 연구에서는 정상적인 T helper cell이 알려진 polyclonal activator에 의해 활성화되어 TGF-β를 분비하는지를 전사수준과 분비수준에서 각각 RT-PCR과 ELISA를 통해 확인한다.

⼑  대식세포의 TGF-β 발현에 대한 병리적 환경 (hypoxia, LDL, IFN-γ, TGF-β)의 영향 평가

- 대식세포가 TGF-β를 발현한다는 사실은 잘 알려져 있다.

- 병리적인 환경에서 즉 hypoxia와 LDL 함유 media에서 TGF-β의 분비를 조사한다.

- 대식세포로는 p388D나 J774 mouse macrophage cell line을 사용하며, 대식세포의 활성을 촉진하는 LPS나 IFN-γ를 병행하여 세포를 자극한다.

- 본 연구를 통해 정상적인 조건과 병리적 환경 하에서의 TGF-β의 발현 양상을 비교 분석할 수 있다.

⼑  비활성 TGF-β의 활성조건 탐색

- 아직까지 latent TGF-β가 어떤 생리적 조건에서 활성화되는지 알려져 있지 않다.

- 따라서 본 연구에서는 생체 내에서 분비되면서 활성화에 기여한다고 알려 있는 여러 유도효소들을 대상으로 생체내 환경과 유사한 조건에서 활성화되는 기작을 밝히고자 한다.

- 활성조건으로는 low pH, plasmin, cathepsin D, 그리고 최근에 보고된 MMP-9 (Yu and Stamenkovic, 2000)등을 대상으로 한다.

⼑ 제 2 단계: TGF-β에 의한 혈관기능 조절인자 (VEGF, MMPs, PAI-1, angiostatin) 발현

TGF-β는 혈관형성 촉진인자 및 저해인자의 발현을 조절하는 양면성이 있다. 본 연구에서는 혈관형성 및 혈관염증에 직간접적으로 관여하는 대식세포를 대상으로 TGF-β에 의한 혈관조절인자의 발현양상을 조사하고자 한다.

⼑ LPS, IFN-γ에 의한 혈관조절인자 발현 양상 조사

- 대식세포는 LPS나 IFN-γ에 의해 활성화되어 다양한 생리활성물질을 분비한다.

- 본 연구에서는 먼저 대식세포가 활성화되었을 때 혈관생성촉진인자 (VEGF, MMPs)와 혈관저해인자 (PAI-1, angiostatin)의 발현조절기작을 분석하고자 한다.

- target 유전자의 전사와 단백질 분비를 RT-PCR과 ELISA로 측정한다.

⼑ TGF-β 유도성 혈관조절인자 발현에 미치는 hypoxia 및 LDL의 영향조사

- 다음 단계에서는 위에서 정착된 방법과 조사된 결과를 바탕으로 병리적인 환경에서의 조절을 이해하 고자 hypoxia와 LDL 함유 media 조건에서 대식세포의 혈관기능 조절인자의 발현양상을 조사한다.

⼑ 염증반응 cytokine (Interleukin-1, 6, TNF-α 등)의 발현조절

- 대식세포는 다양한 염증관여 cytokine을 분비한다.

- 대식세포가 이미 열거한 정상적인 조건과 병리적인 환경에서 분비하는 Interleukin-1, 6, TNF-alpha등의 조절에 대해 분석한다.

- 이 때 TGF-β의 autoregulation도 병행하여 조사한다.

⼑ 제 3 단계: TGF-β1에 의한 혈관기능 조절인자 유도에 대한 신호전달기작 및 조절방법 탐색

⼑ VEGF, MMPs, PAI-1 유전자 reporter 제작 및 특성조사

- 구체적인 기작을 이해하기 위해 VEGF, MMPs, PAI-1 유전자의 promoter를 포함한 reporter를 제작 하여 TGF-β에 의한 활성을 조사한다.

- 확인을 위해 mutant reporter를 제작하여 wild type reporter와 병행 조사

⼑ Smad 단백질의 과발현에 의한 reporter 활성 조사

- TGF-β의 신호전달인자인 Samd 3/4 그리고 inhibitory Smad로 알려진 Smad 6/7을 과발현시켜 위에 서 제작한 reporter의 활성을 조사한다. 본인은 최근 TGF-β의 신호전달에 관한 결과를 발표한 바 있 다 (Park et al., 2001). 이 결과를 토대로 본 연구를 수행하고자 한다.

⼑ AML-2, Ets, NF-kB 단백질의 관여여부 조사

- Smad 분자 외에 TGF-β의 전사조절에 관여한다고 알려진 AML-2, Ets family, NF-kB 유전자를 과 발현시켜 종합적인 조절기작을 분자수준에서 밝힌다.

⼑ 신호전달의 조절방법 탐색

- 최종적인 단계로 위에서 밝혀진 정보를 근거로 혈관기능 조절인자의 발현을 조절할 수 있는 신호전달 제어 물질의 정체를 밝힌다.