연구목표

(가) 최종목표

본 세부과제 연구에서는 stromal ECM remodeling에 대응한 내피세포의 혈관신생 변화양상을 분석하고, ECM 관련분자들이 어떠한 분자적 기전을 통해 내피세포의 혈관신생 기능을 조절하는지를 규명하며 이를 토대로 선발한 유용분자의 혈관신생 조절기능을 확인함으로써, stromal ECM 환경변화가 혈관신생을 어떻게 조절하는지를 이해함과 동시에 새로운 혈관신생 조절기능 표적분자를 개발하고자 한다. 더 나아가서 이들 분자의 발현 조절을 통한 새로운 혈관기능 조절방법을 탐색고자 한다.

(나) 단계별 목표

 

단계	연 구 목 표
제 1 단계 (2001.7-2004.2)	Extracellular matrix에 의한 내피세포의 혈관신생 활성 조절 분석
	1) stromal ECM 환경조성에 따른 내피세포의 혈관신생 수준 변화양상 분석 2) 내피세포의 세포배열 및 관형성에 ECM 단백질 성분들이 미치는 영향 분석 3) 내피세포의 성장, 부착, 이동, 형태분화, 침윤 등을 조절하는 ECM 관련분자 탐색
제 2 단계 (2004.3-2007.2)	Extracellular matrix에 의한 내피세포 활성 조절 기전 규명
	4) ECM 환경조성에 따른 수용성 혈관생성인자의 내피세포 자극신호전달 경로상의 변화양상 조사 5) ECM 관련분자에 의한 내피세포의 integrin 분자를 통한 신호전달 경로 분석 6) ECM 관련분자에 의해 발현이 유도되는 유전자의 탐색 및 혈관신생 단계에 따른 발현수준 분석
제 3 단계 (2007.3-2010.2)	특정분자의 활성 및 발현 조절을 통한 내피세포의 혈관신생기능 변화 유도
	7) ECM/integrin 신호전달경로상의 분자의 활성 및 발현수준 조절을 통한 내피세포의 혈관신생기능 변화수준 조사 8) ECM에 의해 발현이 유도되는 유전자의 인위적 발현수준 조절에 의한 내피세포 혈관신생기능 변화수준 조사 9) 생체수준(동물 model)에서 특정분자의 활성 및 발현수준 조절에 의한 혈관신생 유도/억제 정도 평가

연구내용

본 세부과제 연구에서는 stromal matrix의 혈관신생 조절 기능을 규명하기 위해 먼저 ECM 주요 구성성분 조성 변화에 따른 내피세포의 증식, 부착, 이동, 침윤, 형태분화 등에서의 변화양상을 세포수준에서 분석하고, 특이적 ECM 단백질, ECM 부착단백질, ECM 분해산물, 그리고 주요 stromal cell들 (fibroblast, cancer cells 등)에 의해 remodeling된 ECM 환경에 내피세포가 어떠한 양상으로 반응하는지 조사하여 내피세포의 혈관신생과 관련된 세포활성이 가장 높게 발현되는 ECM 조성을 확립한다. 다음 단계로 최적의 ECM 환경조성이 내피세포내에서 integrin 신호전달경로 중 어떤 성분을 활성화시키며 또한 어떠한 유전자의 발현이 선별적으로 증가하는지를 조사한다. 또한 ECM 환경조성 변화가 VEGF, FGF 등과 같은 cytokine에 대한 내피세포의 반응에 어떠한 영향을 미치고, 특히 이들 cytokine에 의한 신호전달경로상에 어떤 변화가 일어나는지를 조사한다. 이러한 분자수준의 조사를 통해 ECM 환경조성 변화에 따라 생화학적 활성이나 세포내 발현수준이 조절되는 것으로 추정되는 분자들을 대상으로, 내피세포내 어떤 분자의 활성 및 발현수준이 실제로 혈관신생 수준 및 단계에 따라 현저하게 변하는지를 조사하여 혈관신생 조절기능 분자를 선발한다. 마지막 단계에선 이렇게 선발된 기능분자의 세포내 활성 및 발현수준을 인위적으로 증가 또는 감소시켰을 때 실제로 내피세포의 혈관신생기능이 유도 또는 억제되는지를 세포수준 뿐만 아니라 생체수준(동물 model)에서 조사하여 기능분자의 혈관신생 조절기능을 최종적으로 확인한다.

⼑ 제 1 단계:Extracellular matrix에 의한 내피세포의 혈관신생 활성 조절양상 분석

⼑ Stromal ECM 환경조성에 따른 내피세포의 혈관신생 수준 변화양상 분석

Fibroblast 세포주(3T3, Rat-1 등)나 암세포주(sarcoma, hemangioendothelioma, schwannoma 등)들을 배양하고 Triton X-100 또는 γ-irradiation으로 세포들을 제거하여 얻은 ECM-coated filter disk를 사용하여 in vivo angiogenesis assay (CAM assay, mouse)를 행하고 혈관신생 정도를 조사한다. 아울러 이들 stromal 세포의 배양상층액이나, 혈액응고 추출물, VEGF, FGF 등을 stromal ECM에 첨가하였을 때의 변화양상도 조사한다. 아울러 stromal 세포를 배양하여 얻은 ECM-coated plate에 내피세포(primary human capillary epithelial cells, HCE)를 배양하면서 성장 형태를 조사한다.

⼑ 내피세포의 세포배열 및 관형성에 주요 ECM 단백질 성분들이 미치는 영향 분석

HCE 세포를 fibronectin, laminin, collagen (type I, IV), vitronectin, heparin, heparan sulfate 등으로 구성된 3-D gel 상에서 배양하면서 형태분화 (가지성장 및 network 형성) 정도를 관찰하고, 이들 ECM 성분을 다양한 비율을 혼합조성한 경우나 ECM 복합체인 matrigel에 대해서도 조사한다. 아울러 VEGF, FGF을 첨가하였을 때 HCE 세포의 형태분화상에서의 변화도 비교조사한다.

⼑ 내피세포의 성장, 부착, 이동, 형태분화, 침윤 등을 조절하는 ECM 관련분자 탐색

Syndecan thrombospondin-1,2, decorin, tenacin, Cyr61, CTGF, SPARC, fibronectin fragments, endostatin 등과 같은 ECM 관련분자가 첨가된 matrigel로 coating된 plate에 HCE 세포를 배양하면서 세포증식(MTT, thymidine uptake assay), 부착(Cell-ECM adhesion assay) , 이동(colloidal gold motility assay), 침윤(Boyden chamber, Zymogram assay), 형태분화 등을 조사한다. 또한 여러 종류의 암세포 배양상층액을 첨가한 경우에 대해서도 비교조사한다.

⼑ 제 2 단계: Extracellular matrix에 의한 내피세포 활성 조절기전 규명

⼑ ECM 환경조성에 따른 수용성 혈관생성인자의 내피세포 자극신호전달 경로상의 변화양상 조사

제1 단계 연구에서 VEGF나 FGF의 내피세포 활성촉진 기능에 현저한 영향을 미치는 것으로 나타난 stromal ECM 성분조성으로 coating된 plate에 배양한 내피세포에 대해 이들 혈관생성인자의 신호전달 성분으로 기존에 알려진 분자들(tyrosine kinase, K/H-ras, PI3K, AKT, Raf, MEK, ERK, JNK/SAPK 등)을 중심으로 이들 분자의 활성제나 억제제 (genistein, PP1, sumarin, farnesylthiosalicylic acid, wortmanin, PD-98059, SB-203580, anisomycin 등)를 처리하였을 때 일어나는 세포적 변화 (VEGF, FGF에 대한 반응성)를 조사하고 이를 uncoated plate, matrigel-coated plate 상에서 배양한 경우와 비교조사한다. 이 과정에서 현저한 차이를 보이는 것으로 판단된 분자를 면역침전하여 생화학적 활성을 직접 측정, 비교한다

⼑ ECM 관련분자에 의한 내피세포의 integrin 분자를 통한 신호전달 경로분석

제1 단계 연구에서 내피세포의 활성에 현저하게 영향을 미치는 것으로 조사된 ECM 관련분자로 처리한 세포를 대상으로 integrin 신호전달 경로상의 변화를 src kinase, focal adhesion kinase, PI3K/AKT 등을 중심으로 억제제를 사용하여 조사한다. 아울러 내피세포의 α_vβ₃ integrin의 발현수준 및 β-catenin과의 결합정도를 immunoblotting으로 조사하고, cytoskeleton 구조상의 변화를 anti-actin, vinculin 항체를 이용하여 confocal microscope로 조사한다.

⼑ ECM 관련분자에 의해 발현이 유도되는 유전자의 탐색 및 혈관신생 단계에 따른 발현 분석

내피세포를 활성조절 ECM 관련분자로 처리하였을 때 발현이 유도되는 유전자를 일차로 MMP, urokinase와 같은 protease, AP-1 전사인자 및 target 유전자 등과 같이 내피세포의 혈관신생 기능발현과 관련된 것으로 알려진 유전자들을 대상으로 RT-PCR, Northern blotting을 통해 발현수준을 조사한다. 아울러 signal transduction specific cDNA microarray kit를 이용하여 보다 많은 범위의 유전자에 대해 발현변화 (증가 또는 감소)를 분석하여 정밀분석 대상 유전자들을 선발한다. 이러한 일차선발 유전자들의 발현수준 변화가 실제로 혈관신생에 관여하고 있는지를 조사하기 위해 혈관신생 수준이 각기 다른 조직 (정상조직, 상처조직, 초기/중기/말기의 종양조직 등)에 대해 immunohistochemistry를 행하여 혈관부위에서의 이들 유전자 산물의 발현수준을 비교한다.

⼑ 제 3 단계: 특정분자의 활성 및 발현 조절을 통한 내피세포의 혈관신생기능 변화유도

⼑ ECM/integrin 신호전달경로상의 분자의 활성 및 발현수준 조절을 통한 내피세포의 혈관신생기능 변화수준 조사

제2 단계에서 최종 선발된 분자가 신호전달에 관여하는 성분일 경우, 이 분자에 특이적인 활성제나 억제제, 또는 antisense oligonucleotide를 처리하였을 때, 내피세포의 혈관신생관련 세포활성에 뚜렷한 변화가 나타는지를 in vitro angiogenesis assay를 통해 확인한다. 아울러 이 분자를 발현하는 cDNA construct를 virus-mediated transfection시킨 내피세포에 대해서도 세포활성이 현저히 달라지는지도 조사한다.

⼑ ECM에 의해 발현이 유도되는 유전자의 인위적 발현수준 조절에 의한 내피세포 혈관신생기능 변화수준 조사

제2 단계에서 최종 선발된 분자가 ECM에 의해 발현이 유도되는 유전자의 산물일 경우에도 antisense oligonucleotide를 처리하거나 내피세포 transient transfectant들을 제조하여 in vitro angiogenesis assay를 행하고 혈관신생과 관련된 세포활성에 변화가 있는지를 확인한다.

⼑ 생체수준(동물 model)에서 특정분자의 활성 및 발현수준 조절에 의한 혈관신생 유도 또는 억제 정도 평가

위의 in vitro angiogenesis assay 결과가 유의적으로 판단되면 해당 기능분자에 대한 억제제나 활성제를 직접 쥐에 투여하고 상처부위나 종양조직에서의 혈관신생정도를 대조군과 비교분석하여 해당분자의 혈관신생 조절(유도 또는 억제) 기능을 최종적으로 확인한다. 만일 해당분자에 대한 활성 조절물질이 개발되어 있지 않으면 상처/종양 주변세포에 해당유전자를 virus를 이용하여 도입하는 국소적인 gene-therapy를 시도하거나 해당 유전자에 대한 transgenic/knock-out mouse를 주문/제조하여 이들 형질전환 동물 model을 대상으로 혈관신생 정도를 조사, 평가한다