연구목표

(가) 최종목표

본 세부과제에서는 1) 뇌 혈관내피세포가 BBB로 분화하는 과정에서 성상교세포의 역할, 2) 성상교세포에 의하여 뇌혈관세포가 BBB 밀착결합을 형성하는 과정에 관련된 유전자 및 신호전달 과정 규명, 3) 허혈성 자극에 의하여 성상교세포로부터 분비되는 혈관기능 조절 물질과 이러한 물질의 생성을 조절하는 분자적 기전을 규명하고자 한다. 궁극적으로 이러한 결과를 기초로 하여 뇌허혈에 의한 BBB 손상을 방어할 수 있는 치료방법을 개발하는데 응용하고자 한다.

(나) 단계별 목표

단계	연 구 목 표
제 1 단계 (2001.7-2004.2)	성상교세포에 의한 BBB 형성 및 손상관련 유전자 탐색
	1) 성상교세포와 뇌혈관세포 co-culture 시스템의 확립 2) Hypoxia/hypoglycaemia 조건에서 성상교세포 conditioned media에 의한 뇌혈관세포의 사멸 효과 및 기전 분석 3) 성상교세포의 conditioned media에 의한 뇌혈관세포 차별 발현 유전자의 cNDA microarray chip 분석
제 2 단계 (2004.3-2007.2)	성상교세포에 의한 BBB 형성 및 손상 기전 분석
	4) 뇌혈관세포의 분화 및 사멸에 관련된 생리활성물질의 프로테옴 분석 5) 성상교세포에 의하여 뇌혈관세포에서 차별 발현된 유전자의 BBB 조절 기능 분석 6) 성상교세포에 의한 뇌혈관세포에서 adhesion 단백질 전사조절기전 분석
제 3 단계 (2007.3-2010.2)	성상교세포에 기능조절을 통한 BBB 손상 저해 방법 개발
	7) BBB 형성 및 손상관련 중요 유전자의 발현 및 기능을 동물모델을 이용하여 분석 8) BBB 손상 억제를 위한 새로운 타겟의 설정 9) BBB 손상 억제를 위한 후보물질 스크리닝 시스템 개발 및 후보물질 탐색

연구내용

뇌혈액관문은 말초혈관계와는 달리 밀착결합을 형성하며, 이러한 밀착결합은 in vitro상의 뇌혈관세포에서는 잘 유지되지 않는다. 따라서, 성상교세포에 의한 BBB의 밀착결합형성은 in vitro에서 뇌혈관세포와 성상교세포의 co-culture를 통하여 재현하는 것이 가능하다. 단, 성상교세포만으로 뇌혈관세포의 BBB 분화를 관찰하는데 불완전할 수 있기 때문에 필요에 따라 세포외기질 단백질을 조합한 적절한 조건을 구성하는 것이 요구된다. 성상교세포에 의한 BBB의 형성은 Millicell-ERS apparatus (Millipore Corp.)로 전기 저항도 (TER: transendocellular electrical resistance)를 측정하거나 TJ를 형성하는 occludin 단백질의 형광현미경 관찰을 통하여 분석할 수 있다.

BBB의 밀착결합은 세포막에 존재하는 occludin과 이와 결합된 세포질내 단백질인 ZO-1, ZO-2, p130, 7H6, cingulin과 같은 다양한 단백질에 의하여 조절되는 것으로 알려져 있으며 이러한 단백질의 인산화는 BBB의 투과성과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 성상교세포에 의하여 BBB 밀착결합이 조절되는 뇌혈관세포내 신호전달경로는 TJ 단백질의 인산화 경로를 분석하여 규명할 수 있다.

성상교세포는 뇌허혈시 활성화되어 다양한 종류의 사이토카인이나 NO를 분비하여 뇌혈관세포의 투과성, 생존, 및 leukocyte의 adhesion, 세포외기질 분해를 조절하는 단백질의 발현을 변화시켜 BBB 손상을 유발할 수 있다.

따라서, 본 세부과제에서는 위와 같은 BBB의 구조적, 생화학적 특성, 실험적인 방법, 가설에 입각하여 성상교세포에 의한 BBB의 형성 및 병리적 환경하에서 BBB가 손상되는 기전을 규명하고자 한다.

⼑ 제 1 단계: 성상교세포에 의한 BBB 형성 및 손상 관련 유전자 탐색

⼗ 성상교세포와 뇌혈관세포 co-culture 시스템의 확립

⼗ Co-culture 시스템을 이용한 성상교세포에 의한 BBB 전기저항성 변화 분석

⼗ Hypoxia/hypoglycaemia 조건 성상교세포 conditioned media에 의한 BBB 전기저항성 분석

⼗ Hypoxia/hypoglycaemia 조건 성상교세포 conditioned media에 의한 뇌혈관세포의 사멸 효과 및 기전 분석

⼗ Hypoxia/hypoglycaemia 조건 성상교세포 conditioned media에 의한 뇌혈관세포에서

leukocyte adhesion 단백질의 발현 변화 분석

⼗ 성상교세포에서 Hypoxia/hypoglycaemia에 의한 ECM 단백질 분해효소 (MMP) 및 저해제 (TIMPs)의 발현 변화 분석

⼗ 성상교세포의 conditioned media에 의한 뇌혈관세포 차별 발현 유전자의 cNDA microarray chip 분석

⼑ 제 2 단계: 성상교세포에 의한 BBB 형성 및 손상 기전 분석

⼗ 뇌혈관세포의 분화 및 사멸에 관련된 생리활성물질의 프로테옴 분석

⼗ 성상교세포에 의한 뇌혈관세포에서 leukocyte adhesion 단백질 전사조절기전 분석

⼗ 성상교세포에서 Hypoxia/hypoglycaemia에 의한 MMP 및 TIMPs 전사조절 신호전달경로의 분석

⼗ 성상교세포에 의하여 뇌혈관세포에서 차별 발현된 유전자의 BBB 조절 기능 분석

⼗ 성상교세포에 의한 BBB의 밀착결합 변화를 TJ 단백질인 occludin, ZO-1, ZO-2, p130의 발현, localization, 인산화 변화 등을 측정하여 분석

⼑ 제 3 단계: 성상교세포에 기능조절을 통한 BBB 손상 저해 방법 개발

⼗ BBB 형성 및 손상관련 중요 유전자의 발현 및 기능을 동물모델을 이용하여 분석

⼗ BBB 손상 억제를 위한 새로운 타겟의 설정

⼗ BBB 손상 억제를 위한 후보물질 스크리닝 시스템 개발 및 후보물질 탐색