연구목표

(가) 최종목표

Chemical genomics 및 DNA microarray analysis를 이용하여 혈관질환조절 활성을 가지는 화합물을 탐색한 후 세포내 표적분자를 동정하고, 혈관질환에 관여하는 새로운 유전자를 발굴하여 치료후보물질 개발에 응용한다.

(나) 단계별 목표

단계	연 구 목 표
제 1 단계 (2001.7-2004.2)	혈관형성조절 활성물질 탐색 및 분자구조결정
	1) in vitro 및 in vivo assay를 통한 혈관형성조절관련 활성물질 탐색 2) 활성물질의 분리 및 정제 3) 활성물질의 분자구조 결정 및 물리화학적 성질규명
제 2 단계 (2004.3-2007.2)	활성물질의 세포내 작용기전해석 및 DB 구축
	4) 활성물질 처리시 세포의 전체 유전자 발현변화 분석 5) DB를 활용한 활성물질의 세포 내 표적분자 동정 6) 유전자 돌연변이를 이용한 활성물질의 target validation 및 DB 구축
제 3 단계 (2007.3-2010.2)	혈관형성관련 신규 유전자 발굴 및 치료후보물질 개발
	7) 구축된 DB에서 유전자 발현변화율 (log2)이 1 이상 혹은 -1 미만인 유전자들을 선발 8) 신규 유전자 발굴 및 기능해석 9) 혈관질환관련 치료후보물질 개발

연구내용

⼗ 제 1 단계 (2001.7-2004.2): 혈관질환조절 활성물질 탐색 및 분자구조 결정

- 인간 혈관내피세포인 HUVECs를 이용한 nitric oxide (NO) 생성측정, tube formation, chemoinvasion 등 in vitro assay 와 chorioallantoic membrane (CAM) 및 Matrigel plug 등 in vivo assay 통한 혈관질환 조절관련 활성물질을 탐색한다.

- Silica gel column chromatography, thin layer chromatography (TLC), high performance liquid chromatography (HPLC)를 이용하여 활성물질을 분리 및 정제한다.

- EI-MS 및 FAB-MS를 이용하여 활성물질의 분자량을 측정하고, ¹H-, ¹³C-NMR analysis를 이용하여 분자구조를 결정한다.

- 활성물질의 화학구조에서 관능기 (functional group)의 수식 및 유도체 합성을 통하여 물리화학적 성질을

규명하며, 활성이 보다 우수하고 특이적인 물질을 개발한다.

⼗ 제 2 단계 (2004.3-2007.2): 활성물질의 세포내 작용기전 해석 및 DB 구축

- HUVECs에 활성물질을 처리한 후 mRNA를 추출하여 fluorochrome-labeled probe을 제조하고, 대조군의 probe와 함께 DNA chip에 hybridization한다. DNA microarray 분석을 통하여 유전자 발현변화를 log2 scale로 전환한다.

- 기존의 data base를 활용하여 활성물질 처리군과 correlation coefficient (p)값을 비교하여 가장 유사한 data base를 찾아 활성물질의 세포내 표적분자를 추정한다.

- 추정된 표적분자를 coding하는 유전자를 knock out 시키고 그때 나타나는 세포의 전체 유전자 발현변화를 분석하고, 약제처리시와 비교하여 target validation을 실시한다.

- 상기 연구를 통한 유전자 발현변화 분석결과를 data base화한다.

⼗ 제 3 단계 (2007.3-2010.2): 혈관질환관련 신규 유전자 발굴 및 치료후보물질 개발

- 구축된 DB에서 log² 값이 1 이상인 유전자는 혈관형성 억제유전자로 분류하고 -1 이하인 유전자는 혈관형성

촉진유전자로써 분류하여 선발한다.

- 각 선발된 유전자를 PCR 및 southern hybridization을 통해 cloning하여 동정한다. 동정된 유전자를 세포에 transfection하고 NO 생성 및 angiogenesis assay 등을 통하여 phenotype을 분석하여 유전자의 기능을 해석한다.

- 기능이 분석된 유전자를 표적으로하는 신규 활성물질을 탐색하고 혈관질환관련 치료후보물질 개발에 응용한다.