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연구목표
(가) 최종목표
본 연구에서는 신생 혈관 조절인자에 대한 항체를 이용하여 혈관관련 질환에 대한 진단키트를 개발하고자 한다. 하나의
표지물질에 대한 항체 및 진단키트 개발에 많은 시간이 소요되므로 우선 혈관생성을 조절하는데 가장 큰 효과를 보이고 있는 중심 조절인자들에 대한
각각의 진단키트 개발을 목표로 한다.
(나) 단계별 목표
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단계 |
연 구 목 표 |
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제 1 단계 (2001.7-2004.2) |
단일클론항체의 생산 및 분석 |
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1) 항원 단백질 제조 및 단일클론항체 제조
2) 항체 특성조사 및 epitope 결정
3)
키트제작용 항체 선별 및 대량생산 연구 |
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제 2 단계 (2004.3-2007.2) |
혈관질환 진단키트 Formulation |
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4) 환자 혈청 수집 및 질병 연관성 검토
5) 진단키트 제조 조건 확립
6) 시제품 제작
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제 3 단계 (2007.3-2010.2) |
진단키트 유용성 평가에 관한 연구 |
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7) 기준치, 정확도 평가
8) 재현성 평가
9) 검출한계 평가 |
연구내용
⼑ 제 1 단계 (2001.7-2004.2): 신생혈관 조절인자에 대한 단일클론항체의 생산 및 분석
•특이도 조사 : 확보한 단일클론항체의 특이도 확인.
•감수성 조사 : In vivo와 in vitro에서 혈관생성인자의 탐지능력을 측정.
•항체 정제 : 항체의 특성을 규명하기 위하여 각각의 단일클론항체를 생산 정제
• Epitope 조사 :
- 간략한 epitope mapping 방법인 V8 protease를 사용하는 기법을 적용.
- 이 epitope조사를 통하여 항체의 종류를 구별하고 본 연구목적에 부합되는 epitope과 반응하는
항체를 선별하는 중요한 과정
• 대량생산 항체 선정 및 세포주의 대량 배양
-단일클론항체의 특성을 규명한 후 유용성이 높은 항체를 선별하고 하이브리도마 세포주를 마우 스의 복강에
주사하여 항체가 다량 함유되어 있는 복수 생산.
- 생산된 복수에서 Protein-A Column을 사용하여 단일클론항체를 정제
- 정제된 항체는 labeling하여 다양한 용도로 사용
• 키트사용 세포주 선별: 이상의 결과를 종합하여 키트에 적합한 하이브리도마 세포주를 선별함.
⼑ 제 2 단계 (2004.3-2007.2): 신생혈관형성 조절인자 진단키트의 Formulation
• 임상적용 연구:
- 대상선정
- 혈청채취
- 임상병리검사
- 암 병기결정
- 추적관찰
- 결과분석
•진단키트 Formulation
- 진단방법 디자인 ; ELISA, 간편진단형, Chip형
- 코팅 조건 결정
- Optimization
⼑ 제 3 단계 (2007.3-2010.2): 진단 시약의 유용성 평가에 관한 연구
•기준치 (cut-off value)설정
- Receiver Operating Characteristic (ROC) Curve를 이용한 기준치 설정
- 암으로 진단된 환자군과 나머지 질병환자군으로 분류하여 각각의 기준치에 따른 민감도와
특이도로써 ROC curve를 그려서 설정함
•신생혈관 조절인자 진단 kit의 예측치 산출
- 개발 kit의 민감도 (sensitivity), 특이도 (specificity)를 산출함
- 개발 kit의 양성 (positive) 및 음성 (negative) 예측치 (predictive value)를
산출함
- 개발 kit의 효율성 (efficiency)을 검토
- 암의 각 병기 (stage)에 따른 민감도와 특이도를 산출함
•정확도 (accuracy) 평가
- 서로 농도가 다른 6개 이상의 표준물질을 각각 5회 이상 측정하여 평균과 표준편차를 산출함
•정밀도 (precision) 평가
- 검사중 정밀도 (within-run precision) : 임상적으로 의미있는 범위의 값을 갖는 고, 중,
저농도 의 검체를 20개로 분주후 각 20회 반복 측정하여 평균, 표준편차, 변이를 산출함
- 검사간 정밀도 (between-run precision) : 고, 중, 저농도의 검체를 calibration을
달리하여 각 20회 반복 측정한 후 평균, 표준편차, 변이계수를 산출함
•직선성 (linearity) 평가 : hook effect 검사
- 저농도에서 고농도의 농도를 알고 있는 5개 이상의 표준물질을 각각 5회 이상 측정하여 평균과 표준편차를 산출함
•회수율 (recovery rate) 평가
- 건강인의 혼주혈청이나 또는 여성의 혼주혈청에 농도를 알고있는 혈청을 첨가하여 측정 후 참 값에 대한 측정값의
백분율을 산출함
- 서로 다른 두가지 농도의 참고물질을 이용하여 검사함
•검출 한계 (detection limit) 평가 
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