연구목표

(가) 최종목표

말초로부터 들어오는 뇌허혈의 정도에 따른 정보에 따라 혈관의 기능을 조절하는 교감 절전 신경세포의 흥분성, 시냅스 전달, 시냅스 가소성 그리고 세포 내 calcium 농도 조절 기전을 규명하고, 지속적 혹은 반복적 저산소증에 대한 교감 절전 신경세포의 시냅스 가소성 기전을 밝힘으로써 뇌허혈시 혈관의 가소성을 조절하는 뇌세포의 기능을 규명하고자 한다.

(나) 단계별 목표

 

단계	연 구 목 표
제 1 단계 (2001.7-2004.2)	허혈시 교감 절전 신경세포의 흥분성 및 시냅스 전달
	1) 허혈시 교감 절전 신경세포의 흥분성을 결정하는 이온 통로 규명 2) 허혈시 교감 절전 신경세포의 시냅스 연결 3) 허혈시 교감 절전 신경세포의 시냅스 가소성
제 2 단계 (2004.3-2007.2)	허혈시 교감 절전 신경세포의 신호 전달 기전
	4) calcium 통로를 통한 calcium 신호 기전 5) 세포내 calcium 저장고로부터 유리되는 calcium 신호 기전 6) calcium 제거 기전
제 3 단계 (2007.3-2010.2)	뇌허혈에 따른 교감 절전 신경세포의 시냅스 가소성
	7) 뇌허혈 및 대사억제가 교감 절전 신경세포의 흥분성과 시냅스 전달에 미치는 영향 8) 세포내 calcium 신호 기전에 미치는 국소적 저산소증의 영향 9) 반복되는 전신적 저산소증에 대한 교감 절전 신경세포의 시냅스의 반응

연구내용

본 연구에서는 뇌허혈시 신경세포에 의한 혈관가소성 조절 연구를 위하여 in vitro와 in vivo 조건으로 구별하여 뇌세포의 기능 변화는 물론 세포내 신호전달에 직접적으로 관여 할 것으로 생각되는 calcium의 농도변화 기전을 연구하고자 한다. 그러므로 본 과제에서는 뇌혈관 가소성에 미치는 신경세포의 기능을 연구하기 위하여 NMDA 수용체만 발현되어 있는 연수복회측부 신경세포(RVLM)와 교감 절전 신경세포의 뇌절편 및 배양세포를 이용한 patch-clamp 기록법, 세포내 영상기법을 이용하고자 한다. 이때, 세포 내 calcium 신호의 변화는 가능한 calcium의 source로서 NMDA 수용체를 통한 calcium의 유입, 막전압 의존성 calcium 통로 (VDCC)를 통한 calcium의 유입, 그리고 세포 내 저장고로부터 calcium의 유리 등을 조사하고자 한다. 또한 척수내 interneuron으로 부터 알려지지 않은 신경전달물질이 교감 절전 신경세포에 유리될 때 발생하는 신경세포의 세포 내 calcium 농도의 변화 기전과 혈관 확장성 변화의 상관관계를 밝힘으로써 뇌허혈시 신경세포에 의한 뇌혈관의 가소성의 기전을 규명하고자 한다.

⼑ 제 1 단계 (2001.7-2004.2): 허혈시 교감 절전 신경세포의 흥분성 및 시냅스 전달

• 교감 절전 신경세포를 포함하는 뇌 절편 준비

• 교감 절전 신경세포의 확인: 뇌 절편에서 기록한 세포에서 교감신경절에 주입한 retrograde 염료가 검출되는지 확인

• 안정막전압의 기록 및 안정막전압에 영향을 주는 이온전류의 정체 규명

• 교감 절전 신경세포와 시냅스를 이루는 척수 섬유를 자극하여 교감 절전 신경세포에서 시냅스

전류가 기록되는 조건 확립

• 교감 절전 신경세포에 시냅스를 내는 시냅스전 섬유를 고빈도로 자극하여 시냅스 가소성을 유발

⼑ 제 2 단계 (2004.3-2007.2): 허혈시 교감 절전 신경세포의 시냅스 가소성을 조절하는 신경세포의 신호전달 기전

• 막전압을 저분극시켜 이때 유발되는 calcium 전류를 기록하고 VDCC를 통한 calcium 신호의 특성 을 관찰

• calcium 통로 억제제를 무기물 억제제, 유기물 억제제로 나누어 처치하고 VDCC를 통한 calcium

신호에 미치는 효과를 확인

• NMDA 수용체 억제제인 APV와 AMPA 수용체 억제제인 CNQX가 calcium signal에 미치는 효과

• 세포 내 calcium 저장고를 IP3와 ryanodine 저장고로 나누어 특성을 관찰

- caffeine에 의하여 calcium을 유리되는 ryanodine 저장고를 세포 내 calcium imaging으로 확인. - Ryanodine 저장고에 calcium이 유리되는 것이 ryanodine에 의하여 억제되는지 확인.

- IP3 저장고는 ruthenium red나 dantrolene과 같은 IP3 수용체 길항제로 억제되는지 확인.

- 각각의 저장고가 고갈되고 재충전되는 과정을 확인.

⼑ 제 3 단계 (2007.3-2010.2): 교감 절전 신경세포에 의한 허혈성 혈관의 기능조절 기전 규명

• 뇌허혈 및 대사 억제가 교감 절전 신경세포의 세포막 전압 및 이온통로에 미치는 영향 관찰

- 허혈은 그 정의상 혈류를 멈추어야 하는 이유로 세포에 가할수 없으며, 저산소성 자극은 아래와 같은 3 가지 방법으로 가함.

1) inhibition of mitochondrial oxidative phosphorylation: FCCP, CN

2) inhibition of glycolysis: 2-deoxy-D-glucose

3) perfusion with different O₂ content medium (20, 10, 0 % O₂) - 필요에 따라 oxygen chelator를 사용할 것이며, 실제적인 산소분압은 산소감지전극을 이용하여 확인하고자 함.

• 뇌절편에 가하는 국소적 자극과 달리 실험동물에게 반복적으로 전신적 저산소증을 유발한 뒤 교감 절전 신경세포의 시냅스 가소성 및 세포 내 calcium 신호에 유발된 변화와 혈관의 기능 변화를 관찰함.